ባለ ሁለት ገመድ አር ኤን ኤ (dsRNA) ELISA KIT

ይህ ኪት የኢንዛይም-የተገናኘ Immunosorbent Assay (ELISA) ከባዮቲን-ስትሬፕታቪዲን ሲስተም ጋር በማጣመር የዲኤስኤንኤን በቁጥር ለመለካት ከ60 ቤዝ ጥንዶች(ቢፒ) በላይ ርዝመት ያለው ቅደም ተከተል ምንም ይሁን ምን።ሳህኑ በፀረ-dsRNA ፀረ እንግዳ አካላት ቀድሞ ተሸፍኗል።በናሙናው ውስጥ ያለው dsRNA ተጨምሮ በጉድጓዶቹ ላይ ከተሸፈኑ ፀረ እንግዳ አካላት ጋር ይጣመራል።እና ከዚያ ባዮቲኒላድ ፀረ-dsRNA ፀረ እንግዳ አካላት ተጨምረዋል እና በናሙናው ውስጥ ከ dsRNA ጋር ይጣመራሉ።ከታጠበ በኋላ ኤችአርፒ-ስትሬፕታቪዲን ተጨምሮ ከባዮቲንላይትድ ፀረ-dsRNA ፀረ እንግዳ አካላት ጋር ይጣመራል።ከክትባት በኋላ ያልታሰረ ኤችአርፒ-ስትሬፕታቪዲን ታጥቧል።ከዚያም TMB substrate መፍትሄ በHRP ታክሏል እና catalyzed ሰማያዊ ቀለም ምርት ለማምረት አሲዳማ ማቆሚያ መፍትሄ ከጨመረ በኋላ ወደ ቢጫ ተቀይሯል.የቢጫው ጥግግት በሰሌዳ ውስጥ ከተያዘው የ dsRNA ኢላማ መጠን ጋር ተመጣጣኝ ነው።መምጠጥ በ 450 nm ይለካል.

መተግበሪያ

ይህ ኪት ቀሪውን dsRNA በቁጥር ለመለካት ነው።

Kit ክፍሎች

ማከማቻ እና መረጋጋት

1. ላልተጠቀመ ኪት፡- ሙሉው ኪት በመደርደሪያ ህይወት ውስጥ በ2 ~ 8℃ ሊከማች ይችላል።ለማከማቻ መረጋጋት ጠንካራ ብርሃን መወገድ አለበት.

2. ጥቅም ላይ ለዋለ ኪት፡- ማይክሮፕላቱ አንዴ ከተከፈተ እባክዎን ጥቅም ላይ ያልዋሉ ጉድጓዶችን በፕላስቲን ማሸጊያው ላይ ይሸፍኑ እና ማጽጃውን ወደያዘው ፎይል ቦርሳ ይመለሱ እና የፎይል ቦርሳውን ዚፕ ያሽጉ እና በተቻለ ፍጥነት ከተጠቀሙ በኋላ ወደ 2 ~ 8℃ ይመለሱ።ሌሎች ሬጀንቶች ከተጠቀሙ በኋላ በተቻለ ፍጥነት ወደ 2 ~ 8 ℃ መመለስ አለባቸው።

የሚያስፈልጉ ቁሳቁሶች ግን አልተሰጡም።

1. ማይክሮፕሌት አንባቢ በ 450 ± 10nm ማጣሪያ (በ 450 እና 650 nm የሞገድ ርዝመት መለየት ከቻለ የተሻለ ነው).

2. ማይክሮፕሌት ሻከር.

3. ከ RNase-ነጻ ምክሮች እና ሴንትሪፉጅ ቱቦዎች።

የክወና ፍሰት ገበታ

ከመጀመርህ በፊት

1. ከመጠቀምዎ በፊት ሁሉንም የኪት ክፍሎች እና ናሙናዎች ወደ ክፍል ሙቀት (18-25 ℃) ያቅርቡ።ኪቱ በአንድ ጊዜ ጥቅም ላይ የማይውል ከሆነ፣ እባክዎን ለአሁኑ ሙከራ ንጣፎችን እና ሪጀንቶችን ብቻ ያውጡ እና የተቀሩትን ቁርጥራጮች እና ሪጀንቶች በሚፈለገው ሁኔታ ይተዉት።

2. የማጠቢያ ቋት፡- 40ሚሊ 20× የተጠናከረ የመታጠቢያ ቋት በ760ሚሊ የዲዮኒዝድ ወይም የተጣራ ውሃ 800ሚሊ 1× የመታጠቢያ ቋት ያዘጋጁ።

3. መደበኛ፡ ከመጠቀምዎ በፊት የአክሲዮን መፍትሄን በአጭሩ ያሽከረክሩት ወይም ሴንቲሜትር ያድርጉ።የቀረቡት አራት ደረጃዎች ትኩረት 5ng/μL ነው።ለ UTP እና pUTP dsRNA ደረጃዎች፣ እባክዎ የአክሲዮን መፍትሄውን ወደ 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL በSTE ቋት በመቀነስ መደበኛውን ኩርባ ይሳሉ።ለN1-Me-pUTP dsRNA ደረጃዎች፣ እባክዎ የአክሲዮን መፍትሄውን ወደ 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL ከSTE ቋት ጋር በመቀነስ መደበኛውን ኩርባ ይሳሉ።ለ 5-OMe-UTP dsRNA መደበኛ፣ እባክዎ የአክሲዮን መፍትሄውን ወደ 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL ከSTE ቋት ጋር በመቀነስ መደበኛውን ኩርባ ይሳሉ።ደረጃዎች በሚከተለው ገበታዎች እንዲሟሟቸው እንመክራለን።

4. Biotinylated detection antibody እና HRP-streptavidin የሚሰራ መፍትሄ፡ ከመጠቀምዎ በፊት የአክሲዮን መፍትሄን በአጭሩ ያሽከረክሩት ወይም ያሽጉ።ወደ ሥራው ትኩረት በ dilution ቋት ይቀንሱዋቸው.

5. TMB substate: የሚፈለገውን የመፍትሄውን መጠን በተጸዳዱ ምክሮች ይመኙ እና ቀሪውን መፍትሄ እንደገና ወደ ማሰሮው ውስጥ አይጣሉት።የቲኤምቢ ንኡስ ግዛት ለብርሃን ስሜታዊ ነው፣ለረጅም ጊዜ የቲኤምቢ ንኡስ ክፍልን ለብርሃን አታጋልጥ።

ፕሮቶኮልን በመጠቀም

1. ለምርመራው የሚያስፈልጉትን የጭራጎቶች ብዛት ይወስኑ.ጥቅም ላይ የሚውሉትን ክፈፎች በክፈፎች ውስጥ ያስገቡ።በዚህ ሙከራ ውስጥ ጥቅም ላይ ያልዋሉ የቀሩ የሰሌዳ ቁራጮች በከረጢቱ ውስጥ በደረቅ ማድረቂያ እንደገና መታሸግ አለባቸው።ለማቀዝቀዣ ማከማቻ ቦርሳውን በደንብ ይዝጉት.

2. እያንዳንዳቸው 100μL መደበኛ, ባዶ እና ናሙናዎችን ወደ ተገቢው ጉድጓዶች ይጨምሩ.በጠፍጣፋ ማሸጊያው ይሸፍኑ.በ 500rpm በመንቀጥቀጥ ለ 1 ሰዓት በቤት ሙቀት ውስጥ ይንቀጠቀጡ.ናሙናዎቹ በ STE ቋት ወደ ተገቢ ትኩረት ለትክክለኛ ምርመራ መሟጠጥ አለባቸው።

3. የመታጠብ ደረጃ: መፍትሄውን በመምጠጥ በ 250μL ማጠቢያ ቋት ወደ እያንዳንዱ ጉድጓድ በማጠብ ለ 30 ዎች እንዲቆም ያድርጉ.ሳህኑን በሚስብ ወረቀት ላይ በማንጠቅ የማጠቢያ ቋቱን ሙሉ በሙሉ ያስወግዱት።ሙሉ በሙሉ 4 ጊዜ መታጠብ.

4. በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 100μL የባዮቲኒላድ ማወቂያ ፀረ እንግዳ አካላት መፍትሄ ይጨምሩ።በጠፍጣፋ ማሸጊያው ይሸፍኑ.በ 500rpm በመንቀጥቀጥ ለ 1 ሰዓት በቤት ሙቀት ውስጥ ይንቀጠቀጡ.

5. የመታጠብ ደረጃን ይድገሙት.

6. በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 100μL HRP-streptavidin የሚሰራ መፍትሄ ይጨምሩ.በጠፍጣፋ ማሸጊያው ይሸፍኑ.በ 500rpm በመንቀጥቀጥ ለ 30 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ ይንቀጠቀጡ ።

7. የመታጠቢያውን ደረጃ እንደገና ይድገሙት.

8. በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 100μL TMB substrate መፍትሄ ይጨምሩ.በጠፍጣፋ ማሸጊያው ይሸፍኑ.ለ 30 ደቂቃዎች በRT ከብርሃን ጠብቅ ።የከርሰ ምድር መፍትሄ በመጨመር ፈሳሹ ሰማያዊ ይሆናል።

9. በእያንዳንዱ ጉድጓድ ውስጥ 50μL የማቆሚያ መፍትሄ ይጨምሩ.የማቆሚያ መፍትሄን በመጨመር ፈሳሹ ወደ ቢጫነት ይለወጣል.ከዚያ የማይክሮፕሌት አንባቢውን ያሂዱ እና ወዲያውኑ በ 450nm መለኪያ ያካሂዱ።

የውጤቶች ስሌት

1. ለእያንዳንዱ መመዘኛ፣ ቁጥጥር እና ናሙናዎች የተባዙ ንባቦችን አማካኝ እና አማካዩን ዜሮ መደበኛ የኦፕቲካል እፍጋትን መቀነስ።በቋሚ(Y) ዘንግ እና በ dsRNA ትኩረት በአግድም(X) ዘንግ ላይ በመምጠጥ መደበኛ ኩርባ ይገንቡ።

2. ስሌቱን በኮምፒዩተር ላይ በተመሠረተ ከርቭ ተስማሚ ሶፍትዌር እንደ ከርቭ ኤክስፐርት 1.3 ወይም ELISA Calc በ 5 ወይም 4 parameter nonlinear fit model ውስጥ እንዲሰራ ይመከራል።

አፈጻጸም

1. ስሜታዊነት፡-

ዝቅተኛ የማወቅ ገደብ፡ ≤ 0.001pg/μL (ለ UTP-፣ pUTP-፣ N1-Me-pUTP-dsRNA)፣ ≤ 0.01pg/μL (ለ5-OMe-UTP-dsRNA)።

ዝቅተኛ የቁጥር ገደብ፡0.0156 pg/μL (ለ UTP-፣ pUTP-dsRNA)፣0.0312 pg/μL (ለ N1-Me-pUTP-dsRNA)፣0.0625 pg/μL (ለ5-OMe-UTP-dsRNA)።

2. ትክክለኛነት፡ የ Intra-Assay ሲቪ ≤10%፣ የኢንተር-አሳይ ሲቪ ≤10%

3. ማገገም፡ 80% ~ 120%

4.Linearity: 0.0156-0.5pg / μL (ለ UTP-, pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg / μL (ለ N1-Me-pUTP dsRNA), 0.0625-1pg / μL (ለ 5-OMe-UTP-dsRNA).

ግምቶች

1. የቲኤምቢ ምላሽ ሙቀት እና ጊዜ ወሳኝ ነው, እባክዎን እንደ መመሪያው በጥብቅ ይቆጣጠሩ.

2. ጥሩ የአስሳይ መራባት እና ስሜታዊነት ለማግኘት ከመጠን በላይ ምላሽ ያልተሰጡ ሬጀንቶችን ለማስወገድ ሳህኖቹን በትክክል ማጠብ አስፈላጊ ነው።

3. ሁሉም ሪጀንቶች ከመጠቀማቸው በፊት በደንብ መቀላቀል አለባቸው እና በናሙና ወይም በ reagents በሚጨመሩበት ጊዜ ብልጭታዎችን ያስወግዱ።

4. በተጠራቀመ ማጠቢያ ቋት (20x) ውስጥ ክሪስታሎች ከተፈጠሩ እስከ 37 ℃ ድረስ ይሞቁ እና ክሪስታሎች ሙሉ በሙሉ እስኪሟሟቸው ድረስ በቀስታ ይቀላቅሉ።

5. የሶዲየም አዚድ (NaN3) የያዙ ናሙናዎችን ከመገምገም ይቆጠቡ፣ ምክንያቱም የኤችአርፒ እንቅስቃሴን ሊያበላሽ ስለሚችል የ dsRNA መጠን ዝቅተኛ ግምት።

6. በምርመራው ወቅት የ RNase ብክለትን ያስወግዱ።

7. ስታንዳርድ/ናሙና፣ ማወቂያ ፀረ እንግዳ አካላት እና ኤስኤ-HRP እንዲሁ ሳይናወጡ በ RT ሊደረጉ ይችላሉ፣ ነገር ግን ይህ የመለየት ስሜትን በአንድ ጊዜ እንዲቀንስ ሊያደርግ ይችላል።ለዚህ ጉዳይ የ UTP እና pUTP dsRNA ደረጃዎች ከ 2pg/μL እንዲሟሟት እንመክራለን፣ N1-Me-pUTP dsRNA ደረጃዎች ከ4pg/μL እና 5-OMe-UTP dsRNA ደረጃ ከ 8pg/μL መሟሟት አለባቸው።በተጨማሪም HRP-streptavidin የሚሰራ መፍትሄ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 60 ደቂቃ ያፍሱ።ብልጭታ ማንቆርቆሪያን አይጠቀሙ፣ ምክንያቱም ብልጭታ መንቀጥቀጥ ትክክለኛ ያልሆነ ውጤት ሊያስከትል ይችላል።

የተለመደ ውጤት

1. መደበኛ ኩርባ ውሂብ

2. መደበኛ ኩርባ ስሌት

3. የመስመር ማወቂያ ክልል: 0.0312- 1pg / μL