mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase የተገኘው ለቫኪሲኒያ mRNA Cap 2 '-O-Methyltransferase ጂን ከሚሸከመው ከዳግመኛ ኢ. ኮሊ ዝርያ ነው።ይህ ኢንዛይም የሜቲል ቡድንን በ 2′-O ቦታ ላይ ከኮፕ መዋቅር አጠገብ ባለው የመጀመሪያው ኑክሊዮታይድ በአር ኤን ኤ 5 መጨረሻ ላይ ይጨምራል። -0) ካፕ- 1 መዋቅርን ያስከትላል.

የ Cap1 መዋቅር የትርጉም ቅልጥፍናን ሊጨምር ይችላል, የኤምአርኤን ትራንስፎርሜሽን እና ማይክሮ ኢንጀክሽን ሙከራዎችን ያሻሽላል.ይህ ኢንዛይም በተለይ አር ኤን ኤ ከ m7GpppN ቆብ ጋር እንደ substrate ያስፈልገዋል.አር ኤን ኤ በ pN፣ ppN፣ pppN ወይም GpppN በ 5′ መጨረሻ ላይ መጠቀም አይችልም።የታሸገ አር ኤን ኤ በካፕ አናሎግ በመጠቀም ወይም በቫቺኒያ ካፒንግ ኢንዛይም በመጠቀም ኢንዛይም ካፕ በማድረግ በብልቃጥ ግልባጭ ሊዘጋጅ ይችላል።

አካላት

mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase (50U/μL)

10× ካፒንግ ምላሽ ቋት

ማከማቻ

-25 ～- 15 ℃ ለማጠራቀሚያ ( ተደጋጋሚ የማቀዝቀዝ ዑደቶችን ያስወግዱ)

የማከማቻ ቋት

20 ሚሜ Tris-HCl (pH 8.0,25 ℃), 100 ሚሜ NaCl, 1 ሚሜ DTT, 0. 1 ሚሜ EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.

የክፍል ትርጉም

አንድ ክፍል በ 1 ሰዓት ውስጥ በ 37 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ 10 pmoles 80 nt cappped RNA ግልባጭ ለሜቲላይት የሚያስፈልገው የኢንዛይም መጠን ይገለጻል።

የጥራት ቁጥጥር ምርመራዎች

Exonuclease: 50U የ mRNA Cap 2 '-O-Methyltransferase ከ 1μg λ-Hind III ዲኤንኤ በ37 ℃ ለ 16 ሰአታት መፍጨት በአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ እንደተወሰነው ምንም አይነት መበላሸት አይሰጥም።

ኢንዶኑክለስ: 50 U of mRNA Cap 2 '-O-Methyltransferase ከ 1 μg λDNA ጋር በ 37℃ ለ 16 ሰአታት በ agarose gel electrophoresis እንደተወሰነው ምንም አይነት መበላሸት አይሰጥም።

ኒካሴ: 50U mRNA Cap 2 '-O-Methyltransferase በ 1μg pBR322 በ 37 ℃ ለ 16 ሰአታት በ agarose gel electrophoresis እንደተወሰነው ምንም አይነት መበላሸት አይሰጥም።

RNase: 50U የ mRNA Cap 2 '-O-Methyltransferase ከ 1.6μg MS2 አር ኤን ኤ ጋር ለ 4 ሰአታት በ 37 ℃ በአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ እንደሚወሰን ምንም አይነት መበላሸት አይሰጥም።

E. ኮላይ ዲ.ኤን.ኤ: 50U የ mRNA Cap 2 '-O-Methyltransferase ለመገኘት ይጣራል.E. ኮላይ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ TaqMan qPCRን በመጠቀም ለ ፕሪሚየር ልዩE. ኮላይ 16S rRNA ቦታ.የE. ኮላይ የጂኖሚክ ዲኤንኤ መበከል =1 ነውE. ኮላይ ጂኖም

ባክቴሪያ ኢንዶቶክሲን: LAL-ፈተና፣ በቻይና Pharmacopoeia IV 2020 እትም መሠረት ፣ የጄል ገደብ የሙከራ ዘዴ ፣ አጠቃላይ ህግ (1143)።የባክቴሪያ ኢንዶቶክሲን ይዘት =10 EU/mg መሆን አለበት።

የምላሽ ስርዓት እና ሁኔታዎች

1. ተገቢውን ካፕድ አር ኤን ኤ እና አር ናስ-ነጻ H2O በ1.5 ሚሊር የማይክሮፉጅ ቱቦ ውስጥ ወደ የመጨረሻው 16.0 µL ያዋህዱ።

2. በ 65 ℃ ሙቀት ለ 5 ደቂቃዎች ከዚያም በበረዶ መታጠቢያ ለ 5 ደቂቃዎች.

3. በተጠቀሰው ቅደም ተከተል የሚከተሉትን ክፍሎች ይጨምሩ (ለ ለካፒድ አር ኤን ኤ ሜቲኤላይዜሽን

ከ10 በታች

* 10× ካፒንግ ምላሽ ቋት፡ 500 ሚሜ Tris-HCl(pH 8.0፣ 25℃)፣ 50 ሚሜ KCl፣ 10 ሚሜ MgCl2፣ 10 ሚሜ DTT።

4. በ 37 ℃ ውስጥ ለ 1 ሰዓት ይንከባከቡ (ከ 200 nt በታች ለሆኑ ለታላሚው ቁርጥራጭ የ 2 ሰአታት መፈልፈያ ይመከራል).

መተግበሪያዎች

በማይክሮ መርፌ እና በመተላለፍ ሙከራዎች ወቅት የኤምአርኤን መግለጫን ለማሻሻል።

አጠቃቀም ላይ ማስታወሻዎች

1. ምላሽ ከመሰጠቱ በፊት አር ኤን ኤ መንጻት እና ከኒውክሊየስ ነፃ በሆነ ውሃ ውስጥ መሟሟት አለበት, ሁሉም መፍትሄዎች ምንም አይነት ኤዲቲኤ እና ions መያዝ የለባቸውም.

2. በትራንስክሪፕቱ 5'ጫፍ ላይ ያለውን ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ለማስወገድ ከምላሹ በፊት ናሙናውን አር ኤን ኤ በ 65 ℃ ለ 5 ደቂቃዎች ለማሞቅ ይመከራል።ለተወሳሰበ 5 ‹ተርሚናል መዋቅር እስከ 10 ደቂቃ ሊራዘም ይችላል።