የክትባት ቫይረስ ካፒንግ ኢንዛይም

የክትባት ቫይረስ ካፒንግ ኢንዛይም የተገኘው ከዳግመኛ ኢ. ኮላይ ዝርያ የቫኪሲኒያ ካፒንግ ኢንዛይም ጂኖችን ይይዛል።ይህ ነጠላ ኢንዛይም በሁለት ንዑስ ክፍሎች (D1 እና D12) የተዋቀረ ሲሆን ሶስት ኢንዛይም እንቅስቃሴዎች አሉት (አር ኤን ኤ triphosphatase እና guanylyltransferase በ D1 ንዑስ ክፍል እና ጉዋኒን methyltransferase በ D12 ንዑስ ክፍል)።የክትባት ቫይረስ ካፒንግ ኢንዛይም የኬፕ መዋቅርን ለመፍጠር ውጤታማ ነው, ይህም በተለይ ባለ 7-ሜቲልጓይላይት ካፕ መዋቅር (m7Gppp, Cap 0) ከ 5′ አር ኤን ኤ ጋር ማያያዝ ይችላል.የኬፕ መዋቅር (ካፕ 0) በ mRNA ማረጋጊያ, መጓጓዣ እና በ eukaryotes መተርጎም ውስጥ ትልቅ ሚና ይጫወታል.አር ኤን ኤ በኤንዛይም ምላሽ መክተት ውጤታማ እና ቀላል ዘዴ ነው አር ኤን ኤ መረጋጋትን እና ትርጉምን በብልቃጥ ግልባጭ፣ ትራንስፌክሽን እና ማይክሮ ኢንጀክሽን በከፍተኛ ደረጃ ማሻሻል ይችላል።

አካላት

የክትባት ቫይረስ ካፒንግ ኢንዛይም (10 U/μL)

10× ካፕ ቋት

የማከማቻ ሁኔታዎች

-25～- 15℃ ለማጠራቀሚያ ( ተደጋጋሚ የማቀዝቀዝ ዑደቶችን ያስወግዱ)

የማከማቻ ቋት

20 ሚሜ Tris-HCl (pH 8.0)፣ 100 ሚሜ NaCl፣

1mM DTT፣ 0. 1mM EDTA፣ 0. 1% Triton X- 100፣ 50% glycerol።

የክፍል ፍቺ

አንድ የክትባት ቫይረስ ካፒንግ ኢንዛይም 10pmol GTP ወደ 80nt ግልባጭ በ1 ሰአት ውስጥ በ37°ሴ ለማካተት የሚያስፈልገው የኢንዛይም መጠን ተብሎ ይገለጻል።

የጥራት ቁጥጥር

Exonuclease፡10U የክትባት ቫይረስ ካፒንግ ኢንዛይም በ 1μg λ-Hind III ዲኤንኤ በ 37 ℃ ለ16 ሰአታት መፍጨት በአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ እንደተወሰነው ምንም አይነት መበላሸት አይሰጥም።

ኢንዶኑክለስ10U የክትባት ቫይረስ ካፒንግ ኢንዛይም በ 1μg λDNA በ 37℃ ለ16 ሰአታት በአጋሮሴ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ እንደሚወሰን ምንም አይነት መበላሸት አይሰጥም።

ኒካሴ፡10U የክትባት ቫይረስ ካፒንግ ኢንዛይም በ 1 μg pBR322 በ 37 ℃ ለ 16 ሰአታት በአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ እንደሚወሰን ምንም አይነት መበላሸት አይሰጥም።

አርናሴ፡10U የክትባት ቫይረስ ካፒንግ ኢንዛይም ከ1.6μg MS2 አር ኤን ኤ ጋር ለ4 ሰአታት በ37℃ በአጋሮዝ ጄል ኤሌክትሮፊዮሬሲስ እንደሚወሰን ምንም አይነት መበላሸት አይሰጥም።

1.ኮላይ ዲ ኤን ኤ;10U የክትባት ቫይረስ ካፒንግ ኢንዛይም የኢ.ኮሊ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ መኖሩን ታክማን qPCRን በመጠቀም ለኢ.ኮሊ 16S አር ኤን ኤ ሎከስ ልዩ ፕሪመርሮች ይጣራሉ።የኢ.ኮሊ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ መበከል≤1 ኢ.ኮሊ ጂኖም ነው።

2.ባክቴሪያ ኢንዶቶክሲን; LAL-ፈተና፣ በቻይና Pharmacopoeia IV 2020 እትም መሠረት፣ የጄል ገደብ ሙከራ ዘዴ፣ አጠቃላይ ህግ (1143)።የባክቴሪያ ኢንዶቶክሲን ይዘት ≤10 EU/mg መሆን አለበት።

የምላሽ ስርዓት እና ሁኔታዎች

1. የካፒንግ ፕሮቶኮል (የምላሽ መጠን፡ 20 μL)

ይህ አሰራር በ 10μg አር ኤን ኤ (≥100 nt) የካፒንግ ምላሽ ላይ ተፈጻሚ ሲሆን በሙከራ ፍላጎቶች መሰረት ሊጨምር ይችላል።

I) 10μg አር ኤን ኤ እና ከኒውክሌዝ-ነጻ ኤች.*10× Capping Buffer፡ 0.5M Tris-HCl፣ 50mM KCl፣ 10 mM MgCl2፣ 10 mM DTT፣ (25℃፣ pH 8.0)

2) በ 65 ℃ ለ 5 ደቂቃዎች ያሙቁ ፣ ከዚያም ለ 5 ደቂቃዎች በበረዶ መታጠቢያ ውስጥ ይሞቁ።

3) በተጠቀሰው ቅደም ተከተል የሚከተሉትን ክፍሎች ይጨምሩ

*10× Capping Buffer：0.5M Tris-HCl፣ 50mM KCl፣ 10 mM MgCl2፣ 10 ሚሜ DTT፣ (25℃፣ pH8.0)

4) በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ለ 30 ደቂቃዎች ይንከባከቡ ፣ አር ኤን ኤ አሁን ተሸፍኗል እና ለታች አፕሊኬሽኖች ዝግጁ ነው።

2.5′ ተርሚናል መለያ ምላሽ (የምላሽ መጠን: 20 μL)

ይህ ፕሮቶኮል 5′ ትሪፎስፌት ያለው አር ኤን ኤ ለመሰየም የተነደፈ ሲሆን እንደፍላጎቱ መጠን ሊጨምር ይችላል።የመለያ ውህደት ውጤታማነት በአር ኤን ኤ: ጂቲፒ እና በአር ኤን ኤ ናሙናዎች ውስጥ ባለው የጂቲፒ ይዘት ላይ ተጽዕኖ ይኖረዋል።

1) በ1.5 ሚሊር የማይክሮፉጅ ቱቦ ውስጥ ተገቢውን መጠን ያለው አር ኤን ኤ እና ከኒውክለስ-ነጻ ኤች.

2) በ 65 ℃ ለ 5 ደቂቃዎች ያሙቁ ፣ ከዚያም ለ 5 ደቂቃዎች በበረዶ መታጠቢያ ውስጥ ይሞቁ።

3) በተጠቀሰው ቅደም ተከተል የሚከተሉትን ክፍሎች ይጨምሩ.

** የጂቲፒ ሚክስ ጂቲፒ እና አነስተኛ ቁጥር ያላቸውን ማርከሮች ያመለክታል።ለጂቲፒ ትኩረት፣ ይመልከቱወደ ማስታወሻ 3.

4) በ 37°C ለ 30ደቂቃ መክተት፣አር ኤን ኤ 5′ መጨረሻ አሁን ምልክት ተደርጎበታል እና ለታች ተፋሰስ ዝግጁ ነው።

መተግበሪያዎች

1. ከትርጉም ምርመራዎች/በብልቃጥ ትርጉም በፊት ኤምአርኤን መሸፈን

2. የኤምአርኤን 5' ጫፍን መሰየም

አጠቃቀም ላይ ማስታወሻዎች

1.በቫኪሲኒያ ካፒንግ ኢንዛይም ከመታቀፉ በፊት የአር ኤን ኤ መፍትሄን ማሞቅ በግልባጩ 5'end ላይ ያለውን ሁለተኛ ደረጃ መዋቅር ያስወግዳል።በከፍተኛ ደረጃ የተዋቀሩ 5'ends ያላቸውን ግልባጮች ለ 60 ደቂቃዎች ጊዜ ያራዝሙ።

2. ለካፒንግ ምላሾች ጥቅም ላይ የሚውለው አር ኤን ኤ ከመጠቀምዎ በፊት ተጣርቶ ከኑክሊዝ-ነጻ ውሃ ውስጥ መታገድ አለበት።EDTA መኖር የለበትም እና መፍትሄው ከጨው የጸዳ መሆን አለበት.

3. የ5′ን ጫፍ ለመሰየም፣ አጠቃላይ የጂቲፒ ትኩረቱ በምላሹ ውስጥ ካለው የሞላር ኤንአርኤን 1-3 እጥፍ አካባቢ መሆን አለበት።

4. የምላሽ ስርዓቱ መጠን በእውነታው መሰረት ሊጨምር ወይም ሊቀንስ ይችላል.