የዲኤንኤ ማውጣት ሚኒ ኪት
ይህ ኪት የተመቻቸ ቋት ሲስተም እና የሲሊካ ጄል አምድ የማጥራት ቴክኖሎጂን ይቀበላል፣ ይህም ከተለያዩ የTAE ወይም TBE agarose gel ክምችት 70 bp – 20kb DNA ቁርጥራጮችን መልሶ ማግኘት ይችላል።የዲ ኤን ኤ ማስታወቂያ አምድ በተለይ በከፍተኛ የጨው ሁኔታ ውስጥ ዲ ኤን ኤ ላይ ማስተዋወቅ ይችላል።በተጨማሪም ፣ ኪቱ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን በቀጥታ ከ PCR ምርቶች ፣ ኢንዛይማቲክ ምላሽ ስርዓቶች ወይም በሌሎች ዘዴዎች የተገኙ የዲ ኤን ኤ ምርቶችን በማፅዳት እንደ ፕሮቲኖች ፣ ሌሎች ኦርጋኒክ ውህዶች ፣ ኦርጋኒክ ያልሆኑ የጨው ions እና ኦሊጎኑክሊዮታይድ ፕሪመርስ ያሉ ቆሻሻዎችን ያስወግዳል።ማጽዳቱ በ10-15 ደቂቃ ውስጥ መጠናቀቁን ማረጋገጥ ይችላል።የተጣራው ዲ ኤን ኤ በቀጥታ ለሊጅሽን፣ ትራንስፎርሜሽን፣ ኢንዛይም መፈጨት፣ በብልቃጥ ግልባጭ፣ ፒሲአር፣ ቅደም ተከተል፣ ማይክሮ ኢንጀክሽን፣ ወዘተ.
የማከማቻ ሁኔታዎች
በ -15 ~ -25 ℃ ያከማቹ እና በክፍል ሙቀት ያጓጉዙ።
አካላት
| አካላት | (100 rxns) |
| ቋት GDP | 80 ሚሊ ሊትር |
| ቋት GW | 2 × 20 ሚሊ ሊትር |
| Elution Buffer | 20 ሚሊ ሊትር |
| FastPure DNA Mini አምዶች-ጂ | 100 |
ቋት GDP፡የዲኤንኤ ማሰሪያ ቋት።
ቋት GW፡የማጠቢያ ቋት;ከመጠቀምዎ በፊት በጠርሙሱ ላይ በተጠቀሰው መጠን ፍጹም ኢታኖልን ይጨምሩ።
የElution Bufferኢሉሽን
FastPure DNA Mini አምዶች-ጂ፡የዲኤንኤ ማስታወቂያ አምዶች.
የስብስብ ቱቦዎች 2 ml;የስብስብ ቱቦዎች ለማጣራት.
የተዘጋጁ ቁሳቁሶች
1.5 ሚሊር የተጣራ ቱቦዎች፣ ፍፁም ኢታኖል እና አይሶፕሮፓኖል (የዲኤንኤ ቁርጥራጭ ≤100 ቢፒሲ፣ 1 መጠን ይጨምሩ
isopropanol ወደ 1 ጥራዝ ጄል), የውሃ መታጠቢያ.
የሙከራ ሂደት
ከመጠቀምዎ በፊት በታግ ላይ እንደተገለጸው Buffer GW ን ለማሟሟት 80 ሚሊ ኤታኖል ይጨምሩ ፣ በክፍል ሙቀት ውስጥ ያከማቹ።
ሜካኒዝም
1. PCR ምላሽ መፍትሔ
ጄል የማውጣት እቅድ፡ እኩል መጠን ጨምር ቋት GDP PCR ምላሽ የመልሶ ማግኛ እቅድ፡የድምጽ ማቆያ 5 እጥፍ ይጨምሩ
2. የሀገር ውስጥ ምርት የጄል መጠንን አስላ (100 μl 100 ሚ.ግ.
ጄል መፍታት
3. በ 50-55 ቀድመው ይሞቁ℃
4. ማሰሪያ ማጠቢያ
300 μL የመጠባበቂያ የሀገር ውስጥ ምርት* አክል
700 μL Buffer GW ይጨምሩ
700 μL Buffer GW ይጨምሩ
5. ኢሉት
20 - 30μL የElution Buffer ወይም የተቀላቀለ ውሃ ይጨምሩ
ማስታወሻዎች * PCR ምላሽ ፈሳሽ ማግኛ ያለዚህ እርምጃ
ጄል የማውጣት ፕሮግራም
1. ከዲኤንኤ ኤሌክትሮፊዮራይዝ በኋላ የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ለመከፋፈል፣ ነጠላውን የዲኤንኤ ቁራጭ ከአጋሮዝ ጄል በ UV መብራት ያስወግዱ።የጄል እርጥበትን ለመምጠጥ እና በተቻለ መጠን ተጨማሪ አጋሮስን በማስወገድ የጄል ቁራጭን መጠን ለመቀነስ የሚስብ ወረቀት እንዲጠቀሙ ይመከራል።ድምጹን ለማስላት የጄል ቁራጭን (ያለ ማይክሮ ሴንትሪፉጅ ቱቦ) ይመዝን፡ የ100 ሚሊ ግራም ጄልስሊስ መጠን በግምት 100 μL ሲሆን መጠኑ 1 ግራም/ሚሊ ነው።
2. እኩል መጠን ይጨምሩ Buffer GDP, በ 50 ~ 55 ℃ ለ 7-10 ደቂቃዎች (በጄል መጠን መሰረት, ጄል ሙሉ በሙሉ እስኪፈርስ ድረስ የመታቀፉን ጊዜ ያስተካክሉ).በክትባት ጊዜ ቱቦውን 2 ጊዜ ይግለጡ.
Δ ከ1-3 ጥራዞች የ Buffer GDP መጨመር የዲኤንኤ መልሶ ማግኛ ውጤታማነት ላይ ተጽእኖ አይኖረውም።የሚመለሰው የዲኤንኤ ቁራጭ <100 bp ከሆነ፣ 3 ጥራዞች የ Buffer GDP መጨመር ያስፈልገዋል።የጄል ቁርጥራጭ ሙሉ በሙሉ ሲሟሟ, 1 የ isopropanol መጠን ይጨምሩ እና በደንብ ይቀላቅሉ, ከዚያም ወደ ቀጣዩ ደረጃ ይቀጥሉ.
3. Centrifuge ለአጭር ጊዜ ናሙናውን ወደ ቱቦው ግርጌ ለማምጣት FastPure DNA Mini Columns-G ን ወደ ስብስብ ቱቦዎች 2 ሚሊር ያስገቡ እና መፍትሄውን አንድ ጊዜ በከፍተኛ መጠን 700 μL በጥንቃቄ ያስተላልፉ.
ጊዜ ወደ የማጣሪያ አምዶች, ሴንትሪፉጅ በ 12,000 ራፒኤም (13,800 X g) ለ 30-60 ሰከንድ.
4. ማጣሪያውን ያስወግዱ እና 300 μL የ Buffer GDP ወደ አምድ ይጨምሩ, በቤት ሙቀት ውስጥ ለ 1 ደቂቃ, ሴንትሪፉጅ በ 12,000 rpm (13,800 X g) ለ 30-60 ሰከንድ.
5. ማጣሪያውን ያስወግዱ እና 700 μL Buffer GW ይጨምሩ (ፍፁም ኢታኖል አስቀድሞ መጨመሩን ያረጋግጡ!) ወደ አምድ፣ ሴንትሪፉጅ በ12,000 ራፒኤም (13,800 X g) ለ30-60 ሰከንድ።
Δ እባክዎን በማስታወቂያው አምድ ግድግዳ ዙሪያ Buffer GW ን ይጨምሩ ወይም Buffer GW የኋላ ሽፋን ይጨምሩ እና ለ 2 - 3 ጊዜ ተገልብጦ በማቀላቀል ከቧንቧ ግድግዳ ጋር የተጣበቀውን ጨው ሙሉ በሙሉ ለማጠብ ይረዱ።
6. ደረጃ 5 ድገም.
Δ በ Buffer GW ሁለት ጊዜ መታጠብ ጨው ሙሉ በሙሉ መወገዱን እና በቀጣዮቹ ሙከራዎች ላይ ያለውን ተጽእኖ ማስወገድ ይችላል.
7. ማጣሪያውን ያስወግዱ እና ባዶውን አምድ በ 12,000 ራፒኤም (13,800 X g) ለ 2 ደቂቃዎች ሴንትሪፉር ያድርጉት።
8. ዓምዱን ወደ ንፁህ 1.5 ሚሊ ሜትር ማይክሮ ሴንትሪፉጅ ቱቦ ውስጥ አስገባ, ከ 20 - 30 μL የኢሉሽን ቋት ወደ የዓምዱ ሽፋን መሃከል, ለ 2 ደቂቃዎች መጨመር እና ከዚያም በ 12,000 rpm (13,800 X g) ለ 1 ደቂቃ ሴንትሪፉጅ ይጨምሩ.ዓምዱን ይጣሉት, የተገኘውን ዲ ኤን ኤ በ -20 ያከማቹ.
∆ የደረጃ 8ን ከፍተኛ ደረጃ ወደ አምድ በማሸጋገር እንደገና እንዲወጣ ማድረግ እና የElution Bufferን ወደ 55 ቀድመው ማሞቅ (የዲኤንኤ ቁርጥራጭ > 3 ኪ.ቢ.) የመልሶ ማግኛ ቅልጥፍናን ለመጨመር ጠቃሚ ሊሆን ይችላል።
PCR ምርቶች መልሶ ማግኛ ፕሮግራም
ይህ ፕሮቶኮል የዲኤንኤ ቁርጥራጮችን ከ PCR ምርቶች፣ ከኤንዛይማቲክ ምላሽ ሥርዓት እና ከሌሎች የዲኤንኤ ድፍድፍ ምርቶች (ጄኔቲክ ዲኤንኤን ጨምሮ) ለማጣራት ተፈጻሚ ይሆናል።ይህ መፍትሄ የተለያዩ ኑክሊዮታይዶችን ፣ ፕሪመርሮችን ፣ ፕሪመር ዲመርሮችን ፣ የጨው ሞለኪውሎችን ፣ ኢንዛይሞችን እና ሌሎች ቆሻሻዎችን በብቃት ያስወግዳል።
1. የ PCR ምርቶችን፣ የኢንዛይም ምላሽ መፍትሄን እና ሌሎች የዲኤንኤ ጥሬ ምርቶችን ባጭሩ ሴንትሪፉጅ ያድርጉ።ድምፃቸውን በ pipette ይገምቱ እና ወደ sterilized 1.5 ml ወይም 2 ml tube ያስተላልፉ.ድምጹ እስከ 100 μL ድረስ ddH2O ይጨምሩ;ለጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ከፍተኛ ትኩረት በመስጠት ወደ 300 μL በ ddH2O መሟሟት የመልሶ ማቋቋም ቅልጥፍናን ለማሻሻል ይረዳል።
2. 5 ጥራዞች የ Buffer GDP ይጨምሩ፣ በመገልበጥ ወይም በማወዛወዝ በደንብ ይቀላቅሉ።የፍላጎት ዲ ኤን ኤ ቁራጭ>100 ቢፒ ከሆነ ተጨማሪ 1.5 ጥራዞች (ናሙናዎች + ቋት GDP) የኢታኖል መጨመር ያስፈልጋል።
3. ዓምዱን ወደ መሰብሰቢያ ቱቦ ውስጥ መልሰው አስገቡት, ድብልቅውን ወደ አምድ ያስተላልፉ, ሴንትሪፉጅ በ 12,000 ሩብ (13,800 ×g) ለ 30 - 60 ሰከንድ.የተቀላቀለው መፍትሄ መጠን> 700 µL ከሆነ የማስተዋወቂያውን አምድ ወደ መሰብሰቢያ ቱቦ ውስጥ መልሰው ያስቀምጡት, የቀረውን መፍትሄ ወደ ማስታወቂያ አምድ ያስተላልፉ እና በ 12,000 ሩብ (13,800 × g) ሴንትሪፉጅ ለ 30 - 60 ሰከንድ.
4. የሚቀጥለው አፈፃፀም ከ 08-1 / ጄል የማውጣት መርሃ ግብር 5 - 8 ደረጃን ያመለክታል.
መተግበሪያዎች
የተለያዩ የ TAE ወይም TBE agarose gel መጠን;PCR ምርቶች, ኢንዛይም ምላሽ ስርዓቶች ወይም በተለያዩ ዘዴዎች የተገኙ ሌሎች ድፍድፍ ዲ ኤን ኤ ምርቶች.የተመለሱ ቁርጥራጮች ከ70 ቢፒ -20 ኪ.ባ.
ማስታወሻዎች
ለምርምር ብቻ ጥቅም ላይ ይውላል.በምርመራ ሂደቶች ውስጥ ጥቅም ላይ አይውልም.
1. ከመጠቀምዎ በፊት በመለያው ላይ እንደተገለፀው Buffer GW ን ለመጨመር 80 ሚሊር ኤታኖል ይጨምሩ ፣ በክፍል ሙቀት ውስጥ ያከማቹ።
2. በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ማከማቻ ጊዜ የ Buffer GDP በቀላሉ ለመዝለል ቀላል ከሆነ, ከመጠቀምዎ በፊት ለተወሰነ ጊዜ በክፍል ሙቀት ውስጥ ማስቀመጥ ይቻላል.አስፈላጊ ከሆነ, የዝናብ መጠኑ ሙሉ በሙሉ እስኪፈርስ ድረስ በ 37 ℃ የውሃ መታጠቢያ ውስጥ ቀድመው ማሞቅ ይቻላል, ከዚያም ከተደባለቀ በኋላ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል.
3. የውሃ መታጠቢያውን የሙቀት መጠን ወደ 50 ~ 55 ℃ አስቀድመው ያዘጋጁ.
4. በ08-1/ጄል የማውጣት ፕሮግራም ደረጃ 1 የጄል ቁራጭን መጠን መቀነስ የመፍቻ ጊዜን በእጅጉ ይቀንሳል እና የማገገሚያ ቅልጥፍናን ይጨምራል (Linearized DNA በቋሚነት በከፍተኛ ሙቀት ሲጋለጥ በቀላሉ ሃይድሮላይዝ ማድረግ ይቻላል)።አልትራቫዮሌት ጨረር የዲኤንኤ ጉዳት ሊያስከትል ስለሚችል የዲ ኤን ኤ ጄል ለ UV ለረጅም ጊዜ አያጋልጡ።
5. ጄል በ 08-1 / ጄል ኤክስትራክሽን ፕሮግራም ደረጃ 2 ሙሉ በሙሉ ይሟሟት, አለበለዚያ የዲኤንኤ መልሶ ማግኛ ቅልጥፍና በእጅጉ ይጎዳል.
6. የዲኤንኤ ኤሊሽን ቅልጥፍናን ለማሻሻል የሚረዳው Elution Buffer ወይም ddH2O እስከ 55 ℃ ቀድመው ያጥሉት።ዲ ኤን ኤ በ 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5 ውስጥ ለማከማቸት ይመከራል.
