EndoFree Plasmid Maxi Kit
ይህ ኪት ከ 150 - 300 ሚሊ ሊትር የባክቴሪያ መፍትሄ በአንድ ምሽት ለምልሞ ለማውጣት ተስማሚ ነው, የተሻሻለ የኤስዲኤስ-አልካላይን የሊሲስ ዘዴን በመጠቀም ባክቴሪያዎችን ለመቅዳት ተስማሚ ነው.ድፍድፍ ማውጫው ከተለየ የኢንዶቶክሲን ስካቬንገር ጋር ተጣምሮ እና በሴንትሪፍግሽን ተለያይቶ ኢንዶቶክሲን ያስወግዳል።ከዚያም የሲሊካ ጄል ሽፋን በከፍተኛ-ጨው እና ዝቅተኛ-ፒኤች ሁኔታ ውስጥ ባለው መፍትሄ ውስጥ ከፕላዝማ ዲ ኤን ኤ ጋር ይጣመራል።ከዚህ በኋላ ቆሻሻዎችን እና ሌሎች የባክቴሪያ ክፍሎችን ለማስወገድ የእቃ ማጠቢያ ቋት በመጨመር ይከተላል.በመጨረሻም, ዝቅተኛ-ጨው, ከፍተኛ-pH elution ቋት ከሲሊኮን ማትሪክስ ሽፋን ንጹህ የፕላዝማ ዲ ኤን ኤ ለማውጣት ጥቅም ላይ ይውላል.የሲሊካ ጄል ሽፋን ልዩ የማስታወቂያ ሽፋንን ይጠቀማል, እና በአምዱ እና በአምዱ መካከል ያለው የማስታወቂያ መጠን ልዩነት በጣም ትንሽ ነው እና የመድገም ችሎታ ጥሩ ነው.ፌኖል፣ ክሎሮፎርም እና ሌሎች መርዛማ ንጥረ ነገሮች አያስፈልጉም እንዲሁም የኤታኖል የዝናብ ደረጃዎች አይደሉም።ይህ ኪት ከ 0.2 -1.5 ሚ.ግ የንፁህ ከፍተኛ ቅጂ ፕላዝማዲ ዲ ኤን ኤ በፍጥነት ለማውጣት ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል፣ የማውጣት መጠን 80% -90% ነው።ኪት ለየት ያለ የሂደት ቀመር ይጠቀማል ኢንዶቶክሲን ያስወግዳል, የኢንዶቶክሲን ይዘት እጅግ በጣም ዝቅተኛ እና የሕዋስ ሽግግር ተጽእኖ በጣም ጥሩ ነው.የተወሰደው ፕላዝማይድ ኢንዛይም መፈጨት፣ PCR፣ በብልቃጥ ግልባጭ፣ ትራንስፎርሜሽን፣ ቅደም ተከተል እና ሌሎች ሞለኪውላር ባዮሎጂ ሙከራዎች ላይ በቀጥታ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል።
የማከማቻ ሁኔታዎች
RNaseA በ -30 ~ -15 ℃ መቀመጥ እና በ≤0℃ መጓጓዝ አለበት።
Endotoxin Scavenger በ 2 ~ 8 ℃ ለአንድ ወር ሊከማች ይችላል ፣ በ -30 ~ -15 ℃ ለረጅም ጊዜ ማከማቻእና ≤0℃ ላይ ተጓጉዟል።
ሌሎች ክፍሎች በክፍል ሙቀት (15 ~ 25 ℃) ውስጥ መቀመጥ እና በክፍል ሙቀት ውስጥ መጓጓዝ አለባቸው.
አካላት
| አካላት | 10RXNS |
| አርናሴ ኤ | 750 μል |
| ቋት P1 | 75 ሚሊ ሊትር |
| ቋት P2 | 75 ሚሊ ሊትር |
| ቋት P4 | 75 ሚሊ ሊትር |
| Endotoxin Scavenger | 25 ሚሊ ሊትር |
| ቋት PW | 2 × 22 ሚሊ ሊትር |
| ማቋቋሚያ ቲቢ | 20 ሚሊ ሊትር |
| FastPure DNA Maxi Columns (እያንዳንዱ በ 50ml ስብስብ ቱቦ ውስጥ) | 10 |
| Endotoxin-ነጻ ስብስብ ቱቦ | 2 × 5 |
RNaseA፡10 mg / ml, አር ኤን ኤን ለማስወገድ ጥቅም ላይ ይውላል.
ቋት P1፡የባክቴሪያ እገዳ ቋት፣ መጀመሪያ ከመጠቀምዎ በፊት RNaseA ወደ Buffer P1 ያክሉ።
ቋት P2፡የባክቴሪያ ሊሲስ ቋት (ኤስዲኤስ/ናኦኤች የያዘ)።
ቋት P4፡ገለልተኛ ቋት.
Endotoxin Scavenger;ኢንዶቶክሲን ከ ድፍድፍ ፕላዝማይድ ማውጣት ውጤታማ በሆነ መንገድ ያስወግዱት።
ቋት PW፡ማጠቢያ ቋት, ለመጀመሪያ ጊዜ ከመጠቀምዎ በፊት የተቀመጠውን የኤታኖል መጠን ይጨምሩ.
ቋት ቲቢ፡elution ቋት.
FastPure DNA Maxi አምዶች፡የፕላዝሚድ ዲ ኤን ኤ ማስታወቂያ አምዶች.
የስብስብ ቱቦዎች 50 ሚሊ;ማጣሪያ የመሰብሰቢያ ቱቦዎች.
Endotoxin-ነጻ የመሰብሰቢያ ቱቦ፡-የፕላስሚድ ዲ ኤን ኤ መሰብሰቢያ ቱቦዎች.
የተዘጋጁ ቁሳቁሶች
ፍፁም ኢታኖል፣ አይሶፕሮፓኖል፣ 50 ሚሊር ክብ-ታች ሴንትሪፉጅ ቱቦዎች እና 50 ሚሊር ኢንዶቶክሲን-ነጻሴንትሪፉጅ ቱቦዎች.
መተግበሪያዎች
ይህ ምርት ከ 150 - 300 ሚሊ ሊትር የባክቴሪያ መፍትሄ ፕላዝማይድን በብዛት ለማውጣት ተስማሚ ነው.በአንድ ጀንበር የሰለጠነ።
የሙከራ ሂደት
1. 150 - 200 ሚሊ ሊትር (ከ 300 ሚሊ ሜትር ያልበለጠ) የባክቴሪያ መፍትሄ በአንድ ሌሊት ወስደህ በሴንትሪፉጅወደ 11,000 ራፒኤም (12,000 × g) ለ 1 - 2 ደቂቃ.ከመጠን በላይ የሆነውን ያስወግዱ እና ባክቴሪያዎችን ይሰብስቡ.
√ ከ 50 ሚሊር በላይ የባክቴሪያ መፍትሄ በሚሰበሰብበት ጊዜ ባክቴሪያው ሊሰበሰብ የሚችለው የባክቴሪያ መፍትሄ በመጨመር ፣ሴንትሪፍጋሽን ፣ሱፐርናታንትን እና ሌሎች እርምጃዎችን በተመሳሳይ 50 ሚሊር ቱቦ ውስጥ በማስወገድ ነው።
ብዙ ጊዜ.
2. 7.5 ml Buffer P1 ይጨምሩ (እባክዎ RNaseA ወደ Buffer P1 መጨመሩን ያረጋግጡ) ወደ ሴንትሪፉጅባክቴሪያን የያዘ ቱቦ እና በ vortex ወይም pipetting በደንብ ይቀላቀሉ.
√ በዚህ ደረጃ የባክቴሪያዎች ሙሉ በሙሉ እንደገና መነሳት ለምርት በጣም አስፈላጊ ነው, እና እንደገና ከተነሳ በኋላ ምንም አይነት የባክቴሪያ ስብስቦች ሊኖሩ አይገባም.በደንብ ያልተደባለቁ የባክቴሪያ ክምችቶች ካሉ, በሊሲስ ላይ ተጽእኖ ያሳድራል, ይህም ዝቅተኛ ምርት እና ንፅህናን ያመጣል.የባክቴሪያ መፍትሄ OD600 0.65 ከሆነ, ከ 150 ሚሊ ሊትር የባክቴሪያ መፍትሄ በሚወጣበት ጊዜ 7.5 ml Buffer P1 ጥቅም ላይ እንዲውል ይመከራል;OD600 0.75 ሲሆን 8 ml Buffer P1 ጥቅም ላይ መዋል አለበት እና የ Buffers P2 እና P4 መጠኖች በዚሁ መሰረት መቀየር አለባቸው።የባክቴሪያው መፍትሄ መጠን ወደ 200 ሚሊ ሊትር ከጨመረ, ይመከራልየ Buffers P1፣ P2 እና P4 መጠን በተመጣጣኝ ይጨምራል።
3. ከደረጃ 2 7.5 ml Buffer P2 ን በባክቴሪያው እገዳ ላይ ይጨምሩ እና ለ 6 – 8 በቀስታ ወደ ላይ እና ወደ ታች ይቀላቅሉ።ጊዜዎች እና በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 4 - 5 ደቂቃዎች ይትከሉ.
Δ በደንብ ለመደባለቅ በቀስታ ይለውጡ።አዙሪት (Vortexing) የጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ስብርባሪዎችን ያስከትላል፣ በዚህም በተፈጠረው ፕላሲሚድ ውስጥ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን ያስከትላል።በዚህ ጊዜ, መፍትሄው ተለጣጭ እና ግልጽ ይሆናል, ይህም ተህዋሲያን ሙሉ በሙሉ እንደታሸጉ ያሳያል.የፕላስሚዶችን መጥፋት ለማስወገድ የሚፈጀው ጊዜ ከ 5 ደቂቃዎች መብለጥ የለበትም.መፍትሄው ግልጽ ካልሆነ ብዙ ባክቴሪያዎች ሊኖሩ ይችላሉያልተሟላ lysis, ስለዚህ የባክቴሪያ መጠን በትክክል መቀነስ አለበት.
4. ከደረጃ 3 ጀምሮ 7.5 ml Buffer P4 ን በባክቴሪያ መታገድ ላይ ይጨምሩ እና ወዲያውኑ ከ6-8 ጊዜ በዝግታ በመገልበጥ መፍትሄው Buffer P2ን ሙሉ በሙሉ ለማጥፋት።በዚህ ጊዜ ነጭ የፍሎክሳይድ ዝናብ መታየት አለበት.ሴንትሪፉጅ ከ11,000 ራፒኤም በላይ (12,000 × g) ለ 10 – 15 ደቂቃ፣ ተቆጣጣሪውን በጥንቃቄ ወደ አዲስ 50 ሚሊር ክብ-ታች ሴንትሪፉጅ ቱቦ (በራስ የተዘጋጀ) ውስጥ ይግቡ እና ያስወግዱት።ተንሳፋፊውን ነጭ ዝናብ ያስሱ.
Δ Buffer P4 ን ይጨምሩ እና በደንብ ለመደባለቅ ወዲያውኑ ይገለበጡ።በገለልተኝነት ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር የሚችል የአካባቢ ዝናብ እንዳይፈጠር ለመከላከል ነጭው ዝናብ በመፍትሔው ውስጥ በእኩል መጠን እስኪከፋፈል ድረስ ቱቦው እንዲቆም ይተዉት።ከሴንትሪፉግሽን በፊት ምንም አይነት ወጥ የሆነ ነጭ የፍሎክኩላንት ዝናብ ከሌለ እና ከሴንትሪፉግሽን በኋላ ያለው የላይኛው ክፍል ግልፅ ካልሆነ ቱቦው ሊሆን ይችላል።ለሌላ 5 ደቂቃ ማእከላዊ።
5. የኢንዶቶክሲን ስካቬንገር 0. 1 ጊዜ መጠን (10% የሱፐርኔታንት መጠን, ወደ 2.2 ሚሊ ሊትር) ወደ ከፍተኛ ደረጃ ከደረጃ 4 ይጨምሩ እና ወደ ድብልቅ ይለውጡ.መፍትሄውን በበረዶ መታጠቢያ ውስጥ ያስቀምጡት ወይም በተቀጠቀጠ በረዶ (ወይም ማቀዝቀዣ ማቀዝቀዣ) ውስጥ ለ 5 ደቂቃዎች አስገባ መፍትሄው ከተጣራ ወደ ግልጽ እና ግልጽ (ወይም አሁንም) እስኪቀየር ድረስ.በትንሹ የተበጠበጠ), እና አልፎ አልፎ ብዙ ጊዜ ይደባለቁ.
Δ የኢንዶቶክሲን ስካቬንገር ወደ ላይ ከተጨመረ በኋላ ከመጠን በላይ ያለው ንጥረ ነገር ይረብሸዋል ነገር ግንበበረዶ መታጠቢያ ውስጥ ከቀዘቀዙ በኋላ ከመጠን በላይ ፈሳሽ ግልጽ (ወይም በትንሹ የተበጠበጠ) መሆን አለበት.
6. ከፍተኛ ሙቀት በክፍል ሙቀት (> 25 ℃) ለ 10 - 15 ደቂቃዎች ከተቀመጠ በኋላ, እንደ ደረቅ ይሆናል.የሙቀት መጠኑ ወደ ክፍል ሙቀት ይጨምራል.ከዚያም ሱፐርናንት ወደ ድብልቅ መገልበጥ አለበት.
∆ የክፍል ሙቀት ዝቅተኛ ከሆነ ወይም የማውጣት ጊዜን ለመቀነስ ከፈለጋችሁ የሱፐርኔታንትን በ37 ~ 42 ℃ የውሃ መታጠቢያ ገንዳ ውስጥ ለ5-10 ደቂቃ ማፍለቅ ይቻላል እና ቀጣዩ እርምጃ ከሱፐርናታንቱ በኋላ ሊከናወን ይችላል።ብጥብጥ ይሆናል።
7. ደረጃውን ለመለየት ከፍተኛውን በ 11,000 ራፒኤም (12,000 × g) ለ 10 ደቂቃ በክፍል ሙቀት (የሙቀት መጠኑ > 25 ℃ መሆን አለበት)።የላይኛው የውሃ ክፍል ዲ ኤን ኤ ሲይዝ የታችኛው ሰማያዊ የቅባት ክፍል ሽፋን ኢንዶቶክሲን እና ሌሎች ቆሻሻዎችን ይይዛል።አስተላልፍዲ ኤን ኤ የያዘ የውሃ ደረጃ ወደ አዲስ ቱቦ እናዘይቱን ንብርብር ያስወግዱ.
∆ ውጤታማ የሆነ የምዕራፍ መለያየት ባለመቻሉ በሴንትሪፍግሽን ወቅት ያለው የሙቀት መጠን ከ25℃ በላይ መሆን አለበት።የሙቀት መጠኑ በጣም ዝቅተኛ ከሆነ ይከሰታል።
√ የደረጃ መለያየት ውጤታማ ካልሆነ፣ ሴንትሪፍጋሽን የሙቀት መጠኑ ወደ 30℃ እና ሊስተካከል ይችላል።የሴንትሪፉግ ጊዜ ወደ 15 ደቂቃዎች ሊጨምር ይችላል.
↪ ሰማያዊውን የቅባት ሽፋን ኢንዶቶክሲን እና ሌሎች ቆሻሻዎችን ስለሚይዝ አይጠቡ።
ሜካኒዝም
ማገገም የሊሲስ ገለልተኛነት
◇ 7.5 ml Buffer P1 ይጨምሩ
7.5 ml Buffer P2 ይጨምሩ
◇ 7.5 ml Buffer P4 ይጨምሩ
Endotoxin ማስወገድ
የኢንዶቶክሲን ስካቬንገር 0. 1 ጊዜ ከመጠን በላይ የሆነ መጠን ይጨምሩ
ማሰር እና ማጠብ
◇ የኢሶፕሮፓኖል መጠን 0.5 እጥፍ ይጨምሩ
◇ 10 ml Buffer PW ይጨምሩ
◇ 10 ml Buffer PW ይጨምሩ
ኢሉሽን
◇ 1 - 2 ml Buffer ቲቢ ወይም Endotoxin-ነጻ ddH2O ይጨምሩ
