RTL የተገላቢጦሽ ግልባጭ
RTL ሪቨርስ ትራንስክሪፕትሴ የ3'→5' exonuclease እንቅስቃሴ የሌለው እና የ RNase H እንቅስቃሴ ያለው አር ኤን ኤ አብነት-ጥገኛ ዲኤንኤ ፖሊመሬሴ ነው።ይህ ኢንዛይም አር ኤን ኤን እንደ አብነት በመጠቀም ተጨማሪ የዲ ኤን ኤ ሰንሰለትን ለማዋሃድ ሊጠቀም ይችላል፣ ይህም በመጀመሪያ ሲዲኤንኤ ውህደት ላይ በተለይም ለ RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification) ሊተገበር ይችላል።ከ RTL የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕትሴ 1.0 ጋር ሲነጻጸር, ስሜቱ በከፍተኛ ሁኔታ ተሻሽሏል, የሙቀት መረጋጋት የበለጠ ጠንካራ ነው, እና በ 65 ° ሴ ያለው ምላሽ የበለጠ የተረጋጋ ነው.RTL ሪቨርስ ትራንስክሪፕትሴ (ከግሊሰሮል ነፃ የሆነ) lyophilized ዝግጅት፣ lyophilized RT-LAMP reagents ወዘተ ለማዘጋጀት ሊያገለግል ይችላል።
የክፍል ፍቺ
አንድ አሃድ 1 nmol dTTP በ20 ደቂቃ ውስጥ በ50°C ፖሊ(A)•oligo(dT)25 እንደ አብነት-ፕሪመር በመጠቀም አሲድ ወደ ሚችል ንጥረ ነገር ውስጥ ያካትታል።
አካላት
| አካል | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL በግልባጭ ትራንስክሪፕትሴ (ከግላይሰሮል ነፃ) (15U/μL) | 0.1 ሚሊ | 1 ሚሊ | 10 ሚሊ |
| 10×HC RTL ቋት | 1.5 ሚሊ ሊትር | 4 × 1.5 ሚሊ | 5 × 10 ሚሊ |
| MgSO4 (100ሚሜ) | 1.5 ሚሊ ሊትር | 2 × 1.5 ሚሊ | 3 × 10 ሚሊ |
የማከማቻ ሁኔታ
ከ 0 ዲግሪ ሴንቲግሬድ በታች መጓጓዣ እና በ -25 ° ሴ ~ -15 ° ሴ ውስጥ ይቀመጣል.
የጥራት ቁጥጥር
- ቀሪ እንቅስቃሴ የEndonuclease:1 μg λDNA እና 15 ዩኒት RTL2.0 ለ16 ሰአታት በ37 ℃ የተከተተ የ 50 μL ምላሽ በጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ አሉታዊ ቁጥጥር ተመሳሳይ አሰራርን ያሳያል።
- ቀሪ እንቅስቃሴ የExonuclease:የ 50 μL ምላሽ 1 μg Hind Ⅲ ተፈጭተው λDNA እና 15 ዩኒት RTL2.0 ለ16 ሰአታት በ37 ℃ የተከተተ በጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ አሉታዊ ቁጥጥር አይነት ተመሳሳይ አሰራርን ያሳያል።
- ቀሪ እንቅስቃሴ የኒካሴ:የ 50 μL ምላሽ 1 μg supercoiled pBR322 እና 15 ዩኒት RTL2.0 ለ 4 ሰአታት በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ የተከተተ በጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ አሉታዊ ቁጥጥርን ያሳያል።
- ቀሪ እንቅስቃሴ የRNase:የ 10 μL ምላሽ 0.48 μg MS2 አር ኤን ኤ እና 15 ዩኒት RTL2.0 ለ 4 ሰአታት በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ የተከተተ በጄል ኤሌክትሮፊዮራይዝስ አሉታዊ ቁጥጥር ተመሳሳይ ሁኔታን ያሳያል።
- ኮላይ gዲ ኤን ኤ፡የሚለካው በኢ.ኮሊየተወሰኑ የኤችሲዲ ማወቂያ መሳሪያዎች፣15 የ RTL2.0 ክፍሎች ከ1 ያነሱ ይይዛሉኮላይጂኖም
ምላሽ ማዋቀር
የሲዲኤንኤ ውህደት ፕሮቶኮል
| አካላት | ድምጽ |
| አብነት አር ኤን ኤ | አማራጭ |
| ኦሊጎ(ዲቲ) 18~25(50uM) ወይም የዘፈቀደ ፕሪመር ድብልቅ(60uM) | 2 μኤል |
| dNTP ድብልቅ (እያንዳንዱ 10 ሚሜ) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40U/uL) | 0.5 ማይልስ |
| RTL በግልባጭ ግልባጭ 2.0 (15U/uL) | 0.5 ማይልስ |
| 10×HC RTL ቋት | 2 μኤል |
| ከኑክሌር-ነጻ ውሃ | እስከ 20 μL |
ማስታወሻዎች፡-
1) የሚመከረው የጠቅላላ አር ኤን ኤ መጠን 1ng ~ 1μg ነው።
2) የሚመከረው የ mRNA መጠን 50ng ~ 100ng ነበር።
ቴርሞ-የብስክሌት መንዳት ለመደበኛ ሁኔታዎች ምላሽ
| የሙቀት መጠን (° ሴ) | ጊዜ |
| 25 ° ሴa | 5 ደቂቃ |
| 55 ° ሴ | 10 ደቂቃb |
| 80 ° ሴ | 10 ደቂቃ |
ማስታወሻዎች፡-
1) Random Primer Mix ጥቅም ላይ ከዋለ፣የማቀፊያ ደረጃ በ25°ሴ።
2) የታለመ ፕሪመር ድብልቅ ጥቅም ላይ ከዋለ፣ የመታቀፉን እርምጃ በ 55 ° ሴ ለ 10 ~ 30 ደቂቃዎች።
የ RT-LAMP ፕሮቶኮል
| አካላት | ድምጽ | የመጨረሻ ትኩረት |
| አብነት አር ኤን ኤ | አማራጭ | ≥10 ቅጂዎች |
| dNTP ድብልቅ (10ሚሜ) | 3.5 ማይልስ | 1.4 ሚሜ |
| FIP/BIP ፕሪመርስ (25×) | 1 μL | 1.6 μኤም |
| F3/B3 ፕሪመር (25×) | 1 μL | 0.2 μኤም |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0.4 μኤም |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0.5 ማይልስ | 20 U/ ምላሽ |
| RTL በግልባጭ ግልባጭ 2.0 (15U/μL) | 0.5 ማይልስ | 7.5 U / ምላሽ |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/ ምላሽ |
| MgSO4 (100ሚሜ) | 1.5 ማይልስ | 6 ሚሜ (ጠቅላላ 8 ሚሜ) |
| 10×HC RTL Buffer (ወይም 10×HC Bst V2 Buffer) | 2.5 ማይልስ | 1 × (2ሚሜ Mg2+) |
| ከኑክሌር-ነጻ ውሃ | እስከ 25 μl | - |
ማስታወሻዎች፡-
1) ለመሰብሰብ በማወዛወዝ እና በሴንትሪፉጅ በአጭሩ ይቀላቅሉ።በ 65 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ለ 1 ሰዓት የማያቋርጥ የሙቀት መጠን መጨመር.
2) ሁለቱ ማቋረጫዎች እርስ በርስ ሊሰሩ የሚችሉ እና ተመሳሳይ ቅንብር አላቸው.
ማስታወሻዎች
1.ይህ ምርት በ -20 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ሲከማች ነጭ ጠጣር ይፈጥራል.ከ -20 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ አውጥተው ለ 10 ደቂቃ ያህል በበረዶ ላይ ያስቀምጡት.ከቀለጡ በኋላ, በመንቀጥቀጥ እና በመደባለቅ መጠቀም ይቻላል.
2.የሲዲኤንኤ ምርቱ በ -20°C ወይም -80°C ሊከማች ወይም ለ PCR ምላሽ ወዲያውኑ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል።
3. የ RNase ብክለትን ለመከላከል፣ እባክዎን የሙከራ ቦታውን ንፁህ ያድርጉት፣ እና በሚሰራበት ጊዜ ንጹህ ጓንቶች እና ጭምብሎች ያድርጉ።
