የእፅዋት ቀጥታ PCR ኪት

የድመት ቁጥር፡ HCR2020A

የፕላንት ዳይሬክት PCR ኪት የእጽዋት ቅጠሎችን, ዘሮችን እና ሌሎችን በቀጥታ ለማጉላት ተስማሚ ነው, እና ፖሊሶክካርዳይድ እና ፖሊፊኖል የሌላቸው የእጽዋት ናሙናዎችን በከፍተኛ ደረጃ ለማጣራት ሊያገለግል ይችላል.በተመራው የዝግመተ ለውጥ ላይ የተመሰረተው ቀጥተኛ ማጉላት ዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ በእጽዋት ውስጥ ካሉ PCR አጋቾች የላቀ መቻቻል አለው።ይህ በእንዲህ እንዳለ, በ 5 ኪ.ባ ውስጥ የዲ ኤን ኤ ቁርጥራጮችን ለማጉላት ተስማሚ የሆነውን ከፍተኛ የማጉላት አፈፃፀም ይይዛል.በመሳሪያው ውስጥ ያለው ልዩ የሊሲስ ቋት A ትኩስ ወይም የቀዘቀዙ የእፅዋት ቲሹዎችን ለመቅመስ ሊያገለግል ይችላል።ለመሥራት ቀላል ነው እና ሊዛት ሳይጣራ ለማጉላት እንደ አብነት ሊያገለግል ይችላል.ስርዓቱ ድፍድፍ ናሙናዎችን በተደጋጋሚ ከቀዘቀዙ እና ከቀለጠ በኋላ ውጤታማ በሆነ መንገድ እንዲጨምሩ የሚያስችሉ የመከላከያ ወኪሎችን ይዟል።2 × Plant Direct Master Mix የማጉላት ምላሽን ለማከናወን ፕሪመር እና አብነቶችን ማከል ብቻ ነው የሚያስፈልገው፣በዚህም የቧንቧ ስራን በመቀነስ እና የውጤት መባዛትን ያሻሽላል።

አካላት

* Plant Direct Lysis Buffer B የናሙናዎችን የማከማቻ ጊዜ ለማራዘም የፕላንት ቀጥታ Lysis Buffer Aን ገለልተኛ ለማድረግ የሚያገለግል አማራጭ ሬጀንት ነው።እንደ ተጨባጭ ሁኔታ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል.

የማከማቻ ሁኔታዎች

2 × Plant Direct Master Mix፣ በ -30 ~ -15℃ ያከማቹ እና ተደጋጋሚ ቅዝቃዜን እና መቅለጥን ያስወግዱ።Plant Direct Lysis Buffer፣ በ -30 ~ -15℃ ወይም 2 ~ 8℃ ላይ ያከማቹ።

የሙከራ ሂደት

ናሙና ማቀናበር-የእፅዋት ቅጠል

ቀጥተኛ ዘዴ;ወጣት ቅጠሎችን ለመጠቀም ይመከራል.ትንሽ እና ወጥ የሆነ ናሙና ለማግኘት ከ 0.5 - 3 ሚሊ ሜትር የሆነ ቋሚ ዲያሜትር ያለው ቀዳዳ ፓንች ይጠቀሙ እና ከዚያም ናሙናውን በቀጥታ ወደ PCR ስርዓት ይጨምሩ (50 μl ስርዓት ይመከራል).ማስታወሻ, ናሙናው በ PCR መፍትሄ ውስጥ እና በቧንቧ ግድግዳ ላይ አለመሆኑን ያረጋግጡ.ቀጥተኛ PCR ረጅም ቁርጥራጮችን እና ውስብስብ ናሙናዎችን ለማጉላት ጥቅም ላይ ከዋለ ትንሽ ዲያሜትር (0.5 - 1 ሚሜ) ያለው ናሙና እንደ አብነት መጠቀም የተሻለ ውጤት ለማግኘት ይረዳል.

የመፍጨት ዘዴ;ወጣት ቅጠሎችን ለመጠቀም ይመከራል.ትንሽ ቅጠል (ዲያሜትር 1 - 3 ሚሜ ያህል) ይውሰዱ, በ 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab ውስጥ ያስቀምጡት እና በተቻለ መጠን መፍጨት ይችላሉ (ይህ እርምጃ ቅጠሉን በ 100 μል ፒፔት ጫፍ በማጣበቅ). ናሙናውን ለመደፍጠጥ) .ትላልቅ የቅጠል ህብረ ህዋሶች ጥቅም ላይ ከዋሉ (ከ 7 ሚሊ ሜትር አይበልጥም), የዲሉሽን ቋት መጠን ወደ 50 μl ይጨምሩ.ቅጠሎቹ ከተፈጨ በኋላ, መፍትሄው አረንጓዴ ሆኖ መታየት አለበት.ከአጭር ሴንትሪፍግሽን በኋላ፣ 1 μl ሱፐርናታንት ወደ PCR ሲስተም እንደ ምላሽ አብነት ያክሉ።

የሙቀት መለዋወጫ ዘዴ;ወጣት ቅጠሎችን ለመጠቀም ይመከራል.አንድ ትንሽ ቅጠል (ከ1 - 3 ሚሊ ሜትር የሆነ ዲያሜትር) ይውሰዱ, በ 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A ውስጥ ያስቀምጡት እና በ 95 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ ለ 5 - 10 ደቂቃዎች ይሞቁ.ለሊሲስ አስቸጋሪ ለሆኑ ቅጠሎች የሊሲስ ጊዜ በትክክል ሊራዘም ይችላል (ከ 20 ደቂቃዎች ያልበለጠ).ትላልቅ የቅጠል ህብረ ህዋሶች ጥቅም ላይ ከዋሉ (ከ 7 ሚሊ ሜትር አይበልጥም), የዲሉሽን ቋት መጠን ወደ 50 μl ይጨምሩ.ካሞቁ በኋላ ለአጭር ጊዜ ሴንትሪፉል ያድርጉ እና 1 μl ሱፐርናታንት ወደ PCR ሲስተም እንደ ምላሽ አብነት ጨምር።

ናሙና ማቀናበር- የእፅዋት ዘር

የመፍጨት ዘዴ;በ 5 ሚሜ ዲያሜትር ዘሮችን ለመቁረጥ ማጭድ ይጠቀሙ, ወደ 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A ላይ ይጨምሩ እና ናሙናውን በ pipette ጫፍ ወይም ሌሎች መሳሪያዎች ይፍጩ.አዙሪት በአጭሩ እና በክፍሉ የሙቀት መጠን ለ 3 - 5 ደቂቃዎች ይቆዩ.የዘር ናሙናው በዲሉሽን ቋት ውስጥ መግባቱን ያረጋግጡ።ከአጭር ሴንትሪፍግሽን በኋላ፣ 1 μl ሱፐርናታንት ወደ PCR ሲስተም እንደ የምላሽ አብነት ይጨምሩ።

የሙቀት መለዋወጫ ዘዴ;በ 5 ሚሜ ዲያሜትር ውስጥ ዘሮችን ለመቁረጥ ማጭድ ይጠቀሙ, ወደ 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A ላይ ይጨምሩ እና በ 95 ° ሴ ለ 5 - 10 ደቂቃዎች ይሞቁ.ለሊሲስ አስቸጋሪ ለሆኑ ቅጠሎች የሊሲስ ጊዜ በትክክል ሊራዘም ይችላል (ከ 30 ደቂቃዎች ያልበለጠ).ካሞቁ በኋላ ለአጭር ጊዜ ሴንትሪፉል ያድርጉ እና 1 μl ሱፐርናታንት ወደ PCR ሲስተም እንደ የምላሽ አብነት አብነት ይጨምሩ።

ሀ.መቀሶች ወይም ሌሎች መሳሪያዎች ተስማሚ መጠን ያላቸውን ናሙናዎች ለመቁረጥ ሊያገለግሉ ይችላሉ;ጡጫ ወይም መቀስ እንደገና ጥቅም ላይ ከዋለ በናሙናዎች መካከል መበከልን ለመከላከል ከእያንዳንዱ ጥቅም በፊት በ 2% የሶዲየም hypochlorite መፍትሄ ማጽዳት አለባቸው።

ለ.ከመጠቀምዎ በፊት የፕላንት ቀጥታ Lysis Buffer ሙሉ በሙሉ መቅለጥዎን ያረጋግጡ።ቋቱ ዝልግልግ ከሆነ ወይም የዝናብ መጠን ካለው፣ ከመጠቀምዎ በፊት ሙሉ በሙሉ ለማቅለጥ በ 37 ℃ ላይ ሊሞቅ ይችላል።

ሐ.በምላሽ ስርዓት ውስጥ ያለው የአብነት መጠን በተክሎች ቁስ መጠን እና በተጨመረው ፈሳሽ ልዩነት መሰረት በትክክል ማስተካከል ይቻላል.

የእፅዋት ቀጥታ Lysis Buffer

በዚህ ምርት ውስጥ የሚገኘው Plant Direct Lysis Buffer A የአብዛኛውን የእጽዋት ቲሹዎች ጂኖም ለመልቀቅ በጥብቅ የተመቻቸ ሲሆን ለአጭር ጊዜ ድፍድፍ እፅዋትን በ4℃ ላይ ለማከማቸት ምቹ ነው።ናሙናው ረዘም ላለ ጊዜ (ለምሳሌ ከ1-2 ወራት) ማከማቸት ካስፈለገ የሱፐርኔታንትን ወደ አዲስ EP ቱቦ ማዛወር እና በ -20 ℃ ላይ ማስቀመጥ ይመከራል።ናሙናዎቹን ይበልጥ በተረጋጋ ሁኔታ ለማከማቸት፣ በተዘዋወረው ከፍተኛ መጠን ያለው የእፅዋት ዳይሬክት Lysis Buffer B ይጨምሩ ፣ በደንብ ይቀላቅሉ እና በ -20 ℃ ያከማቹ።የተረጋጋው የማከማቻ ጊዜ እንደ ተክሎች ናሙናዎች እና ግዛቶች ይለያያል.

ምላሽ ስርዓት

ሀ.በውስጡም MG²⁺በመጨረሻው የ 2 ሚ.ሜ.

ለ.ለእያንዳንዱ ፕሪመር የመጨረሻውን የ 0.4μM ክምችት ለመጠቀም ይመከራል.ፕሪመርን ከመጠን በላይ መጠቀም ልዩ ያልሆነ ማጉላትን ያስከትላል።

ሐ.ጥቅም ላይ የዋለው የናሙና መጠን እንደ ትክክለኛው ሁኔታ ሊስተካከል ይችላል.ድፍድፍ lysed ናሙና በአንድ ምላሽ ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለው መጠን ከጠቅላላው የምላሽ መጠን ከ2-20% ሊስተካከል ይችላል።በጣም ብዙ ናሙናዎችን መጠቀም የማጉላት ውድቀት ሊያስከትል ይችላል.

ምላሽ ፕሮግራም

ሀ.የመነሻ ዲናቹሬሽን (98 ℃፣ 5 ደቂቃ) የእጽዋት ቲሹ ሊስሲስን ያበረታታል፣ ለ PCR ማጉላት የሚያገለግል ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ ይለቀቃል።ጊዜውን አያሳጥሩ ወይም የሙቀት መጠኑን አይቀንሱ.

ለ.ከፕሪመር ቲም እሴት ወይም 2 ~ 4℃ ከቲኤም እሴት በላይ እንዲያዋቅሩት ይመከራል።በዚህ ምርት ውስጥ ጥቅም ላይ የሚውለው ቀጥተኛ ማጉላት ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ ከተለመደው ታክ ዲ ኤን ኤ ፖሊሜሬዝ የተለየ ነው፣ እና ለምላሽ ማደንዘዣ የሙቀት መጠን ልዩ መስፈርቶች አሉት።ለተወሳሰቡ አብነቶች፣ ቀልጣፋ ማጉላት የሚቀነሰው የሙቀት መጠንን በማስተካከል እና የማራዘሚያ ጊዜን በማራዘም ሊሳካ ይችላል።

ሐ.የማጉላት ምርቱ ርዝመት ≤1 ኪ.ባ ከሆነ, የማራዘሚያው ጊዜ በ 30 ሰከንድ / ኪ.ባ.የማጉላት ምርቱ ርዝመት> 1 ኪ.ባ ከሆነ, የማራዘሚያው ጊዜ በ 60 ሰከንድ / ኪ.ባ.

መ.ለተወሳሰቡ ናሙናዎች ወይም ናሙናዎች ዝቅተኛ የማጉላት ውጤት, የዑደቶች ብዛት በትክክል ወደ 40 -50 ዑደቶች መጨመር ይቻላል.

መተግበሪያዎች

የእጽዋት ቲሹዎችን በቀጥታ ለማጉላት እና ፖሊሶካካርዳድ እና ፖሊፊኖል የሌላቸው የእጽዋት ናሙናዎችን በከፍተኛ ደረጃ ለማጣራት ተፈጻሚ ይሆናል.

ማስታወሻዎች

ለምርምር ብቻ ጥቅም ላይ ይውላል.በምርመራ ሂደቶች ውስጥ ጥቅም ላይ አይውልም.

1. ለድፍ እፅዋት ማጉላት ወይም ቀጥተኛ ማጉላት፣ ስርዓቱ፣ ፕሪመርሮች እና አሠራሮች ትክክል መሆናቸውን ለማረጋገጥ ሙከራውን ከመጀመራቸው በፊት የተጣራ ጂኖሚክ ዲ ኤን ኤ እንደ አወንታዊ ቁጥጥር መጠቀም ይመከራል።

2. በዚህ ኪት ውስጥ ጥቅም ላይ የዋለው ቀጥተኛ ማጉላት ዲ ኤን ኤ ፖሊመሬሴ ጠንካራ የማጣራት እንቅስቃሴ አለው።የቲኤ ክሎኒንግ መደረግ ካለበት, አድኒን ከመጨመራቸው በፊት ዲ ኤን ኤውን ለማጣራት ይመከራል.

3. የመጀመሪያ ደረጃ ንድፍ መመሪያ;

ሀ.በፕሪመር 3′ መጨረሻ ላይ ያለው የመጨረሻው መሠረት G ወይም C እንዲሆን ይመከራል።

ለ.በፕሪመር 3′ መጨረሻ ላይ ባሉት የመጨረሻዎቹ 8 መሠረቶች ውስጥ ተከታታይ አለመግባባቶች መወገድ አለባቸው።ሐ.በፕሪመር 3′ ጫፍ ላይ የፀጉር ማያያዣዎችን ያስወግዱ።

መ.የፊት ፕሪመር እና የተገላቢጦሹ የቲኤም እሴት ልዩነት ከ 1 ℃ ያልበለጠ እና የቲኤም እሴት ወደ 60 ~ 72 ℃ ማስተካከል አለበት (Primer Premier 5 የቲኤም ዋጋን ለማስላት ይመከራል)።

ሠ.ከአብነት ጋር ያልተጣመሩ ተጨማሪ ተጨማሪ የፕሪመር ቅደም ተከተሎች፣ የፕሪመር ቲም እሴትን ሲያሰሉ መካተት የለባቸውም።

ረ.የፕሪሚየር GC ይዘት 40% -60% እንዲሆን ይመከራል.

ሰ.በፕሪመር ውስጥ የ A, G, C እና T አጠቃላይ ስርጭት በተቻለ መጠን መሆን አለበት.ከፍተኛ GC ወይም AT ይዘቶች ያላቸውን ክልሎች ከመጠቀም ይቆጠቡ።

ሸ.በፕሪመር ውስጥ ወይም በሁለት ፕሪመር መካከል 5 ወይም ከዚያ በላይ የሆኑ ተጨማሪ ቅደም ተከተሎች እንዳይኖሩ እና በሁለት ፕሪመር 3′ መጨረሻ ላይ 3 ወይም ከዚያ በላይ የሆኑ ተጨማሪ ቅደም ተከተሎች እንዳይኖሩ ያስወግዱ።

እኔ.ልዩ ያልሆነ ማጉላትን ለመከላከል የፕሪመርን ልዩነት ለመፈተሽ የNCBI BLAST ተግባርን ይጠቀሙ።